免疫熒光的原理

免疫熒光（Immunofluorescence,IF）原理免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測定含量。

紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖免疫熒光實驗的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細(xì)胞片制備（通俗的說法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，細(xì)胞片的質(zhì)量對實驗的成敗至關(guān)重要，原因很簡單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片（SlidesorCoverslips）的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。

固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實驗結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或WesternBlot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響。

　　用于免疫熒光染色的染料需具備以下幾個條件：

熒光染料應(yīng)有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)；

熒光染料對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收；

發(fā)射光波長與激發(fā)光波長之間應(yīng)有較大的波長差；

容易與被標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合而不影響抗體自身的特異性。

1.異硫氰酸熒光素（FITC）：可產(chǎn)生亮綠色熒光。FITC是免疫熒光標(biāo)記最chang用的熒光探針。

2.德州紅：與生wu素偶聯(lián)的抗體有很強的親和力，產(chǎn)生紅色熒光。

3.藻膽蛋白類：主要包括藻紅蛋白（PE）、藻青蛋白（PC）、別藻青蛋白（APC）三類。多發(fā)生橙色至紅色熒光。

4.能量傳遞復(fù)合染料