分析蛋白純化方法及其優(yōu)缺點
1.蛋白沉淀蛋白能溶于水是因為其表面有親水性氨基酸,在蛋白質的等電點處若溶液的離子強度特別高或者特別低,蛋白則傾向于從溶液中析出。硫酸銨是沉淀蛋白zui常用的鹽,因為它在冷的緩沖液中溶解性好,冷的緩沖液有利于保持目的蛋白的活性。
2.緩沖液的更換雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度,但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強度的緩沖液。假如你用硫酸銨將蛋白沉淀出來,毫無疑問蛋白是處在高鹽環(huán)境中,需要想辦法脫鹽,可用的方法有利用半透膜透析,通過勤換透析液體去除鹽分,此法尚可,但需幾個小時,通常要過夜,也難以用予大規(guī)模純化中。
3.離子交換色譜這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中zui有效方法?;诘鞍着c離子交換樹脂間的相互電荷作用,通過選擇不同的緩沖液,同一種蛋白既可以和陰離子交換樹脂(能結合帶負電荷的分子)結合,也可以和陽離子交換樹脂結合。樹脂所用的帶電基團有四種:二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹脂;羧甲基用于弱的陽離子交換樹脂;季銨用于強陰離子交換樹脂;甲基磺酸酯用于強陽離子交換樹脂。蛋白質由氨基酸組成,氨基酸在不同的pH環(huán)境中所帶總電荷不同。
4.親和層析親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結合而滯留,其他雜蛋白會流過柱子。本方法存在的問題是:單抗非常昂貴,而且也需先純化;單抗與目的蛋白結合力太強.要用苛刻的條件來洗脫,這會使目的蛋白失活并破壞單抗;混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體或與它們非特異結合;
5.疏水作用層析蛋白是由疏水性和親水性氨基酸組成的。疏水性氨基酸位于蛋白空間結構的中心部位,遠離表面的水分子。親水性氨基酸殘基則位于蛋白表面。由于親水性氨基酸吸引了許多的水分子,所以通常情況下整個蛋白分子被水分子包圍著,疏水性氨基酸不會暴露在外。在高鹽濃度的環(huán)境中蛋白的疏水性區(qū)域則會暴露并與疏水性介質表面的疏水性配基結合。不同的蛋白疏水性不同,與疏水作用力大小也不同,通過逐漸降低緩沖液中鹽濃度沖洗柱子,在鹽濃度很低時,蛋白恢復自然狀態(tài),疏水作用力減弱被洗脫出來。
6.排阻層析也叫凝膠過濾或分子篩。排阻層析柱的填充顆粒是多孔的介質,柱中圍繞著顆粒所能容納的液體量叫流動相,也稱無效體積。太大的蛋白不能進入顆粒的孔內,只能存在于無效體積的溶液中,將會zui早從柱中洗脫出來,對這部分蛋白無純化效果。