ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中問題及解決方法
科研elisa試驗(yàn)以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)上得到了廣泛的應(yīng)用,但操作中的各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)試驗(yàn)的檢測(cè)效果影響較大,如不注意,有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。上海遠(yuǎn)慕生物將操作中各個(gè)環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)于下:
下面分析Elisa試驗(yàn)操作中可能影響結(jié)果的原因,并給出相應(yīng)的解決辦法
1.選擇試劑
選擇質(zhì)量優(yōu)良的檢測(cè)試劑,嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作,操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。
2加樣
可能原因:①血清或血漿標(biāo)本分離不好即進(jìn)行加樣;②手工操作中,加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時(shí)間過長(特別是室內(nèi)溫度較高時(shí));③加完標(biāo)本再加酶試劑時(shí)酶濺出孔外。解決辦法:①標(biāo)本為血清:將血液先自然存放1-2小時(shí)后,再用3000rmp離心15分鐘;標(biāo)本為血漿:必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管,采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次,放置一段時(shí)間后,3000rpm離心15分鐘;若在幾天內(nèi)檢測(cè),可放在2-8℃冰箱中,若要貯存,則置于-20℃的低溫冰箱內(nèi)。②加樣后及時(shí)放入孵箱。③加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干。④如果采用AT或其他全自動(dòng)加樣,選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。⑤標(biāo)本較多時(shí),請(qǐng)分批操作。
3.孵育
可能原因:①孵育時(shí)未貼封片或加蓋,使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā),吸附于孔壁,難于清洗*;②孵育時(shí)間人為延長,導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍,難以清洗*。解決辦法:①貼封片或加蓋;②按說明步驟嚴(yán)格控制操作時(shí)間。
4.洗板
可能原因:①采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。②采用半自動(dòng)洗板機(jī)洗板時(shí),洗液量不足,導(dǎo)致洗板不*;洗板針堵塞,抽吸不*;洗板不暢,導(dǎo)致洗板效果差。③反應(yīng)板過多造成洗板等待時(shí)間長。解決辦法:①保證洗液注滿各孔,洗板針暢通,洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干;②合理安排,或多用幾臺(tái)洗板機(jī)。
5.顯色
可能原因:①顯色劑配制后放置時(shí)間過長或使用過期顯色劑;②加顯色劑時(shí)濺出孔外造成液體回流。解決辦法:①顯色劑盡量在臨用前配制,堅(jiān)持不用過期顯色劑,肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用;②加樣時(shí)保持顯色劑不外流;③A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。
6.終止
可能原因如加終止液時(shí)產(chǎn)生較多氣泡,導(dǎo)致假陽性增加。所以在加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
7.讀板
如讀板時(shí)板底不清潔等。應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。
所以在整個(gè)操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸;盡可能實(shí)現(xiàn)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化,有效提高檢測(cè)質(zhì)量。
在實(shí)際操作中,除了選擇優(yōu)良試劑外,必須嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作,同時(shí)作好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng),以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)檢測(cè)每一份標(biāo)本,才能保證檢測(cè)質(zhì)量?,F(xiàn)在國內(nèi)已有相當(dāng)數(shù)量的單位擁有全自動(dòng)酶標(biāo)儀,這對(duì)于實(shí)現(xiàn)ELISA標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)、提高檢測(cè)質(zhì)量起到了重要作用。