剛開始做 Western blot 的同學們想必都大多都是研究生，雖然科研經歷還不是特別豐富，但情感經歷一定都比較豐富吧。

同學們想想自己剛談戀愛的時候，你剛喜歡一個人卻還沒表白之前，是不是每天都要想盡一切辦法了解他/她的愛好，他/她的習慣，他/她每天的路線等等，等你心里有數(shù)之后再開始考慮如何表白？

做實驗也一樣，在開始 Western 之前，盡可能多的了解你的目的蛋白，這和談戀愛一樣，這樣表白成功的概率才會大大增加。

當然，表白失敗也很正常，我們之前做的功課只是增加成功的概率而已，并不能減少失敗的概率，所以同學們做實驗時也不要過于有心里負擔，怕這怕那的，要保持一個自然的心態(tài)，否則容易抑郁。

今天我們就來看一看生物信息學的各種神器是如何來幫助我們的 Western blot 實驗。大家在查找抗體的時候有沒有看見免疫原的序列和這兩個圖標呢？

這個意思就是說廠家在生產這個抗體的時候，先是合成了一段肽鏈，這個肽鏈的氨基酸序列是從蛋白質序列里面摘錄的，下面 blast with 意思就是分別和 NCBI 的數(shù)據(jù)庫或 Expasy 的蛋白質數(shù)據(jù)庫里的蛋白質氨基酸序列進行比對。

這個 blast 算法是比較復雜的，但對于我們醫(yī)學科研來說，只需要知道 blast 就是一個序列比對的算法和工具就可以了。

前段時間有同學拿 α 腎上腺素能受體這個蛋白來問我，想得到一些指導，那么我就從以下五個問題來幫助他分析一下這個蛋白。

一：有沒有這個蛋白的抗體？

我們以 Abcam wang站為例，簡單搜索一下，發(fā)現(xiàn)有很多相關的抗體，對于受體這樣豐都不高的蛋白質，還是建議選擇單克隆抗體。

二：蛋白在什么組織中表達？

這個同學拿這個蛋白來問我的時候說，想研究大腦里的表達情況。如果你沒有太多時間去研究綜述的話，簡單的辦法就是看 wiki 百科了。從 wiki 的介紹里可以看到，這個受體在神經元里是能夠表達的，所以這個問題就解決了。

三：蛋白在哪里？

這個從 wiki 百科句話我們就看到了，這是一個 G 蛋白偶聯(lián)受體，肯定是一個跨膜蛋白無疑了，這也意味著這個蛋白不是那么容易做的。

四：如果是跨膜蛋白，跨幾次？

既然是跨膜蛋白，跨了幾次膜，有幾個壓基在胞外，有幾個亞基在胞內？這時我們可以用 SOSUI 這個wang站來查詢。

五：蛋白的序列？分子量？PI？

我們先要從 NCBI 里查找一下這個蛋白質的氨基酸序列，我們以小鼠為例（mus musculus），如下圖所示：

然后我們把這個序列貼到 SOSUI 里面：

然后接得到這這些結果：

從這個結果我們知道這個蛋白跨膜 7 次，在胞內有兩個較大的亞基，因此我們選擇裂解液至少也要用 RIPA 而不能用 NP40，否則不能把這個蛋白從細胞膜里面拽出來，或者需要用專門的膜蛋白提取試劑盒來操作。

選抗體的時候需要注意一下它的免疫原氨基酸序列是否是胞內的氨基酸序列，因為這樣抗體識別的效果是jia的。

然后我們要計算一下 PI，可以用這個工具：

輸入氨基酸序列之后就得到了分子量和等電點 PI：

這個信息對于我們選擇哪種轉膜緩沖液非常有幫助。

如果 PI 接近轉膜緩沖液的 pH 的話，蛋白質電離程度小，帶的電荷就少，轉印效率就會非常低。

所以對這種蛋白質，你選擇常規(guī)的 pH8.8 的轉膜緩沖液可能就不合適，至少應該選 pH11 的 CAPS 轉膜緩沖液或者用 0.7% 乙酸的酸性轉膜液效果才會比較好。

否則不管你轉膜時間多長，蛋白質都在凝膠里一動不動，顯然實驗室不會出結果的。如果你用酸性轉膜液的話，記得把膜放在凝膠的上面，因為此時蛋白質是往負極移動的。

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