細(xì)胞裂解液各成分的作用與制備過程
點擊次數(shù)：701 更新時間：2023-06-20
細(xì)胞裂解液各成分的作用：
1、第一種50mmol/L Tris-HCl是緩沖液，保證細(xì)胞裂解時PH值也能穩(wěn)定，Tris是一種有機堿。
2、第二種1.0 mmol/L EDTA是一種金屬螯合劑。
3、第三種150 mmol/L NaCl是等滲體系電解質(zhì)，用于協(xié)調(diào)細(xì)胞膜內(nèi)外離子平衡。
4、第四種0.1% SDS是十二烷基硫酸鈉，是一種表面活性劑和還原劑，有增溶作用。
制備細(xì)胞裂解液實驗流程：
1. 收集yi蛋白酶消化的細(xì)胞并離心，用PBS清洗。
2. 用100μl 裂解緩沖液冰浴溶解沉淀10min（每500000個細(xì)胞20μl裂解緩沖液）。
3. 10000rpm，4°C離心10min，取上清轉(zhuǎn)移至新管。
4. 用考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白質(zhì)濃度。
5. 用裂解緩沖液將溶液濃度調(diào)到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80°C儲存。
6. 按照1：1體積比混合2×樣品緩沖液，煮沸5min后，室溫放置5min。
7. 短時離心后點樣電泳檢測。
溶液準(zhǔn)備：
裂解緩沖液：
0.15M NaCl, 5mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton×100, 10mM Tris-Cl(pH 7.4); 使用前加 5mM DTT, 0.1mM PMSF 異丙醇和5mM ε-氨ji己酸
2×樣品緩沖液：
130mM Tris-HCl（pH8.0）, 20%（v/v）甘油, 4.6%（w/v）SDS, 0.02%溴酚藍(lán), 2%DTT
PBS（pH7.4）：
10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl
